杏鲍菇组织分离、纯化复壮、品比鉴定试验报告
发布时间：2015-11-03 浏览次数;5319
刘文海 研究员、教授
杏鲍菇培植基地
杏鲍菇
食药用菌细胞分裂周期较短、分化较快，变异的几率较大，菌种生长过程中，据测定大约366个细胞平均就有一个细胞发生自然变异；在同一个室内栽培同一个品种，由于自然杂交也容易产生遗传性变异；组织体或菌丝体感染病毒以及菌种保藏过程中，由于外在条件温度、光照等的刺激也会产生变异，因此菌种优良性状的遗传是相对的，变异却是绝对的。一般生产中使用的菌种一至两年，菌种种性的优良性状就会丢失或部分丢失，并会影响食药用菌栽培中产量、质量的提高，有时会产生严重影响。故杏鲍菇工厂化生产企业在一年内必须有专人进行3至4次分离、纯化、复壮工作，最好是两个月一次，才能确保杏鲍菇菌种保持优良性状的相对稳定。
一、材料与方法
1、材料
（1）参试菌株
隆富兴杏鲍菇、云阳杏鲍菇、万州杏鲍菇
（2）供试培养基
①母种培养基
杏鲍菇采用PDA综合培养基，配方如下：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g（按琼脂使用说明浓度），硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，蛋白胨5g，VB1 10mg，水1000ml，pH自然。
②原种培养基配方
粗木屑3%，细木屑3%，小麦粒90%，麸皮2%，轻钙1.5%，石灰0.5%，灭菌前pH8.0~8.5，含水量60%~62%。用750ml广口瓶装
③栽培种培养基配方
白杨枝条(14*0.7*0.7cm3)，粗木屑13%，细木屑13%，小麦粒67%，麸皮5%，轻钙1.5%，石灰0.5%，灭菌前pH8.0~8.5，含水量60%~62%。用800~1000ml广口瓶装。
④杏鲍菇栽培袋基质的配方：栽培袋规格18*36*0.005cm高压聚丙烯塑料袋
甘蔗渣35%，玉米芯35%，粗木屑15%，细木屑15%或粗木屑20%，细木屑10%，每包麸皮100g，豆粕50g，玉米粉50g，石灰10~12g，轻钙1.5%，灭菌前pH8~8.5，含水量63~65%。
2、杏鲍菇组织分离方法
（1）子实体的选取
有目的的选择具有典型的杏鲍菇形状，外表细嫩，无虫蛀无病斑的子实体。需从小到大分三次逐步挑选：第一次是菇体长至一指半时；第二次是菇体长至五公分时；第三次是菇体八分熟时，采取逐步淘汰法，最后确定最优的2~3根子实体。
（2）杏鲍菇组织分离操作过程
①备好分离器材
刀、镊子、钩子、铲子、无菌水、75%酒精、无菌纱布、酒精灯、口罩、污水杯、乳胶手套、无菌培养皿。
②消毒
先将操作者的双手与所有的工具用75%酒精或0.1%升汞液擦拭一遍，酒精灯点燃后还需将所有的分离工具（刀、钩子、镊子等）灼烧一遍。菇体先用无菌水冲洗几次，然后用无菌纱布吸干水分。
③杏鲍菇组织分离的过程
用刀切得菌盖与菌柄，只留菌盖与菌柄的交接处的菇体组织，将切得组织块放于无菌培养皿内，再用无菌刀与镊子将组织块切成小正方块，再用无菌接种钩接入试管内培养基中，放在23~25℃培养箱中恒温培养。
（3）杏鲍菇尖端菌丝纯化
待菌丝块直径长到1-2cm时，筛选菌丝长势较好、菌丝不稀疏且较圆整的试管，进行转管纯化。
在无菌条件下，用接种钩在气生菌丝最好处钩1~2根菌丝在另一只试管培养基内。菌丝长满后再重复一至两次。
纯化后的斜面试管，需进行转管保藏，按常规方法做原种、栽培种、栽培袋，准备品比试验，出菇鉴定后，确定为最优菌株，方可用于生产。
3、杏鲍菇品比鉴定方法
品比鉴定分两个子项目进行，即营养生长和生殖生长的鉴定，均采取常规的基质配制、拌料、装袋、灭菌、冷却、接种、养菌、出菇、包装的操作工艺进行。
（1）杏鲍菇分离纯化菌株菌丝生长情况的品比鉴定方法
①供测定的菌株
从6月22日开始做了隆富兴杏鲍菇、云阳杏鲍菇、万州杏鲍菇的组织分离，经过纯化已获得隆富兴杏鲍菇纯化菌株、云阳杏鲍菇纯化菌株、万州杏鲍菇纯化菌株纯化菌株的纯化菌株各1株，设原有菌株为对照。
②分离纯化菌株的测定内容与方法
对以上提供的四个菌株进行生长情况的测定。测定内容与方法如下：
a. 菌丝生长速度，每天由专人对试管种、原种、栽培种的菌丝生长情况进行定点测量，用cm/d表示；
b.菌丝长势，用“+”、“++”、“+++”表示，即“+”表示菌丝长势一般、“++”表示菌丝长势较强、“+++”表示菌丝长势强；
c.菌丝厚度，用“+”、“++”、“+++”表示，即“+”表示菌丝厚度一般、“++”表示菌丝较厚、“+++”表示菌丝厚，也可用毫米分三个档次表示；
d.菌丝整齐度，用“+”、“++”、“+++”表示，即“+”表示菌丝整齐度一般、“++”表示菌丝较整齐、“+++”表示菌丝整齐；
e.接种至菌丝长满的时间，用“天”表示，以50%达到满管、满瓶为标准。
（2）杏鲍菇分离纯化菌株出菇情况的品比鉴定方法
杏鲍菇分离纯化菌株出菇情况分为小试和中试两个阶段进行品比鉴定的，小试每个菌株处理为25袋，中试每个处理以一个出菇库为单位，每库在8000袋以上。其品比鉴定内容和方法如下：
①菇色，用肉眼直观方法观察；
②菇形，分两部分进行，即形状与发育等级，形状分为棒状、保龄球状，发育等级分为四级：正常、较正常、畸形、弯曲，用肉眼直观方法评价。
③每袋产量，用kg/袋表示，分为每袋总产kg/袋、成品菇kg/袋、次菇kg/袋和总产与对照增减%四个子项目，均用精确到1g的台秤称取；
④品质，分为味道与口感两项。
⑤中试产量方面要增加总袋数和总产两个子项目。
二、试验结果
1、经过分离、纯化后杏鲍菇的菌丝生长情况品比结果
由表一可见菌丝生长情况，云阳、万州及隆富兴杏鲍菇试管种和原种菌丝生长速度差异不大，隆富兴杏鲍菇栽培种菌丝生长速度稍快于云阳杏鲍菇和万州杏鲍菇。杏鲍菇菌丝长势较弱，试管种菌丝较稀疏、较薄，有爬壁现象，菌丝整齐度较好。
表一 经分离、纯化后杏鲍菇新菌株的菌丝生长品比结果表
|
品种 |
生长速度（cm/d） |
菌丝长势 |
菌丝厚度 |
菌丝整齐度 |
接种至菌丝长满的时间（d） | |
|
云阳
杏鲍菇 |
试管种 |
0.55 |
++ |
++ |
+++ |
12 |
|
原种 |
0.48 |
++ |
|
+++ |
22 | |
|
栽培种 |
0.61 |
++ |
|
+++ |
28 | |
|
万州杏鲍菇 |
试管种 |
0.52 |
++ |
++ |
+++ |
12 |
|
原种 |
0.46 |
++ |
|
+++ |
22 | |
|
栽培种 |
0.59 |
++ |
|
+++ |
28 | |
|
隆富兴杏鲍菇 |
试管种 |
0.54 |
++ |
++ |
+++ |
12 |
|
原种 |
0.49 |
++ |
|
+++ |
22 | |
|
栽培种 |
0.65 |
++ |
|
+++ |
28 | |
|
杏鲍菇CK |
试管种 |
0.5 |
++ |
++ |
+++ |
12 |
|
原种 |
0.49 |
++ |
|
+++ |
22 | |
|
栽培种 |
0.61 |
++ |
|
+++ |
28 | |
2、杏鲍菇小试的出菇情况品比结果，详见表二。
表二 杏鲍菇小试的出菇品比结果表
|
品种 |
菇色 |
菇形 |
每袋产量（kg/袋） |
品质
（味道、口感）
| |||||||
|
菇形 |
发育等级 |
总产（kg/袋） |
成品菇（kg/袋） |
次菇（kg/袋） |
总产与对照增减比率（%） | ||||||
|
正常 |
较正常 |
畸形 |
弯曲 | ||||||||
|
云阳杏鲍菇 |
乳白色 |
棒状 |
正常 |
|
|
|
0.46 |
0.38 |
0.08 |
19.5 |
杏仁香味、口感脆嫩 |
|
万州杏鲍菇 |
乳白色 |
棒状 |
|
|
|
|
|
|
|
|
杏仁香味、口感脆嫩 |
|
隆富兴杏鲍菇 |
乳白色 |
棒状 |
|
较正常 |
略有畸形 |
|
0.45 |
0.36 |
0.09 |
16.8 |
杏仁香味、口感脆嫩 |
|
杏鲍菇CK |
乳白色 |
棒状 |
|
|
略有畸形 |
|
0.365 |
0.31 |
0.075 |
0 |
杏仁香味、口感脆嫩 |
注：次菇含菇蕾和碎菇
3、杏鲍菇分离纯化新菌株中试出菇品比结果，详见表三。
表三 杏鲍菇分离纯化新菌株中试出菇品比结果表
|
品种 |
菇色 |
菇形 |
产量（斤） |
品质
（味道、口感）
|
| ||||||||
|
菇形 |
发育等级 |
参试包数（包） |
总产量（kg） |
每袋产量（kg/袋） |
| ||||||||
|
正常 |
较正常 |
畸形 |
弯曲 |
| |||||||||
|
总产（kg/袋） |
成品菇（kg/袋） |
次菇（kg/袋） |
| ||||||||||
|
云阳杏鲍菇 |
乳白色 |
棒状 |
正常 |
|
|
|
8220 |
3562.6 |
0.435 |
0.335 |
0.1 |
杏仁香味、口感脆嫩 |
|
|
万州杏鲍菇 |
乳白色 |
棒状 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
杏仁香味、口感脆嫩 |
|
|
隆富兴杏鲍菇 |
乳白色 |
棒状 |
|
较正常 |
略有畸形 |
|
8376 |
3559.7 |
0.425 |
0.32 |
0.105 |
杏仁香味、口感脆嫩 |
|
|
杏鲍菇CK |
乳白色 |
棒状 |
|
|
|
略有畸形 |
8397 |
3610.7 |
0.43 |
0.335 |
0.09 |
杏仁香味、口感脆嫩 |
|
三、讨论与分析
1、从表一杏鲍菇菌丝生长速度比较可看出 三株分离纯化菌株和对照菌株，试管种、原种、栽培种达到满管、满瓶的时间粗略看无差异，均分别为12天、22天、28天。菌丝长势也基本相同。但从斜面试管、原种和栽培种精确测量菌丝生长速度还是有一定的差异性，如云阳杏鲍菇斜面试管菌株菌丝生长速度0.55cm/d，均快于隆富兴、万州和对照杏鲍菇。原种隆富兴与对照菌丝生长速度为0.49cm/d，均快于云阳和万州菌株。栽培种隆富兴菌丝生长速度为0.65cm/d，均快于云阳、对照和万州菌株。由此看出，分离的三个菌株与对照相比，营养生长的遗传特性没有明显变化，但云阳的菌株要快于其他菌株。这是在云阳杏鲍菇子实体分离纯化后筛选出新的变异菌株。原种、栽培种的菌丝生长速度以隆富兴和对照菌株都快于其他，这可能与原有培养基质和培养条件有密切关系。
2、从表二、表三小试、中试产量比较上看有明显差异。小试结果每袋单产最高的是云阳分离菌株，其次是隆富兴分离菌株，它们的每袋总产与成品菇产量分别为：云阳0.46kg/袋、0.38kg/袋；隆富兴0.45kg/袋、0.36kg/袋；比对照分别提高了19.5%、16.8%。中试结果每袋从菇形看，菇形、菇色、形状没有改变，但分离后畸形菇和弯曲菇基本没有，非常整齐，而对照都有一定程度的畸形菇和弯曲菇，比较整齐。由此看出经过组织分离纯化后，筛选出的新菌株在产量和品质上都有明显优势，克服了反复继代生产而带来的种性退化、产量与品质下降的现象，建议规模化、工厂化生产杏鲍菇的企业必须把菌种的分离纯化工作放在重要位置，克服菌种的退化现象，从而确保稳产、高产。
3、从我们这次进行杏鲍菇组织分离、纯化复壮、品比鉴定的试验实践，我们认为分离纯化成败的关键点有以下几点：
（1）选择杏鲍菇分离的材料必须按照三步走的方法，进行选择七至八分熟的具有典型遗传性状的优良子实体，这是获得分离成功的基础。
（2）根据杏鲍菇的子实体组织分离接点最好选择是菌柄与菌盖交界处的薄片状生长点，其分离优势较强，易成功。
（3）杏鲍菇组织分离挑取的菌块适宜的培养条件也是成功的关键，根据实践，杏鲍菇的培养条件为温度22℃~24℃，室内空气相对为湿度60%~70%，无光照。
（4）挑取分离的杏鲍菇组织块在无菌条件下三天后开始纯化，及时淘汰菌丝萌发不良的组织块，然后每隔2-3天挑选一次为好。
（5）在适当时候可以在较劣势环境下进行分离纯化，容易筛选出抗逆性更强的新菌株。
4、今后还要继续做的试验工作
（1）万州杏鲍菇的小试、中试需及时进行；
（2）已经筛选出的云阳、隆富兴杏鲍菇新菌株的经过小试、中试增产明显、品质良好，应组织宣传在杏鲍菇工厂化生产基地上大面积应用推广；
（3）建议把组织分离、纯化复壮、品比鉴定作为工厂化食用菌生产企业的一项重要工作，摆在议事日程上，由专人负责进行认真实施，确保食用菌规模化生产达到品质优良、稳产高产的目的。
小兰、李卓良、王强、杨俊
指导老师：刘文海
